콜로이드 금의 특성 및 준비
(1) 콜로이드 금의 구조
금 솔이라고도 알려진 콜로이드 금은 금염이 원래의 금으로 환원된 후 형성된 금 입자의 현탁액입니다. 콜로이드 금 입자는 기본적인 금핵(원자금 Au)과 이를 둘러싸는 이중 이온층으로 구성되어 있으며, 내부의 음이온층(AuC12-)은 금핵의 표면에 밀접하게 연결되어 있고, 외부의 이온층은 층 H+는 콜로이드 용액에 분산되어 졸에 없는 콜로이드 금의 현탁 상태를 유지합니다.
콜로이드 금 입자의 기본 금 핵은 이상적인 구형 핵이 아니며 작은 콜로이드 금 입자는 기본적으로 구형이고 큰 콜로이드 금 입자(일반적으로 30nm 이상)는 대부분 타원형입니다. 콜로이드 금의 입자 형태는 전자 현미경으로 관찰할 수 있습니다.
(2) 콜로이드 금의 특성
1. 콜로이드 특성 금 콜로이드 입자는 대부분 크기가 1~100nm이며 작은 금 입자가 액체에 안정하고 균일하며 단일 분산 상태로 현탁되어 콜로이드 금 용액을 형성합니다. 따라서 콜로이드 금은 콜로이드의 많은 특성, 특히 전해질에 대한 민감성을 가지고 있습니다. 전해질은 콜로이드 금 입자의 주변 영구 수화 층을 파괴하여 콜로이드의 안정한 상태를 파괴하여 분산 된 단일 금 입자를 큰 입자로 응집시키고 액체에서 침전시킵니다. 단백질과 같은 특정 고분자 물질은 콜로이드 금을 보호하고 안정성을 향상시킬 수 있습니다.
2. 연색성 작은 입자의 콜로이드는 빨간색이지만 크기가 다른 콜로이드의 색상은 특정 차이가 있습니다. 가장 작은 콜로이드 금(2-5nm)은 주황색-노란색이고 중간 크기의 콜로이드 금(10-20nm)은 포도주색이며 더 큰 콜로이드 금(30-80nm)은 적자색입니다. 이 특징에 따르면 콜로이드 금의 색을 육안으로 관찰하면 금 입자의 크기를 대략적으로 추정할 수 있다.
삼. 흡광성 콜로이드 금은 가시광선 영역에서 단일 광흡수 피크를 가지며, 이 광흡수 피크의 파장(λmax)은 510~550nm 범위이며 콜로이드 금 입자의 크기에 따라 달라진다. - 입자 콜로이드 금은 장파장 쪽으로 치우쳐 있고, 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
(3) 콜로이드 금의 제조
1. 준비 방법 콜로이드 금의 준비는 대부분 환원 방법을 채택합니다. Chlorauric acid (HauC14)는 주요 환원 물질이며 일반적으로 사용되는 환원제는 구연산 나트륨, 탄닌산, 아스코르빈산, 백린탄, 수소화붕소나트륨 등입니다. 환원제의 종류와 환원강도에 따라 0.8nm에서 150nm 범위의 콜로이드 금을 제조할 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 준비 방법은 구연산염 환원 방법입니다. 구체적인 작동 방법은 다음과 같습니다.
(1) 먼저 HauC14를 0.01% 수용액에 넣고 100ml를 취하여 가열하여 끓인다.
(2) 교반하면서 1% 구연산삼나트륨(Na3C6H5O7·2H2O) 수용액 일정량을 정확히 가한다.
(3) 15분간 계속 가열하여 끓인다. 이때 옅은 노란색의 클로로금산 수용액은 구연산나트륨을 가한 직후 회색으로 변하다가 검은색으로 변하다가 서서히 붉은색으로 변하는 것을 관찰할 수 있다. 전체 과정은 약 2~3분 정도 소요됩니다.
(4) 상온으로 식힌 후 증류수로 원래의 부피로 되돌린다.
이 방법으로 입자 크기가 16-147nm인 콜로이드 금을 제조할 수 있습니다. 금 입자의 크기는 준비하는 동안 추가되는 시트르산삼나트륨의 양에 따라 다릅니다. 표 19-1은 입자 크기가 다른 4가지 콜로이드 금을 준비할 때 시트르산삼나트륨의 용량을 나열한 것입니다.
2. 지침
(1) 클로라우린산은 조해하기 쉬우므로 건조하고 빛을 피하여 보관하여야 한다.
(2) 클로로금산은 금속에 대한 부식성이 높으므로 클로로금산 수용액을 조제할 때 금속 주걱을 사용하여 클로로금산을 칭량해서는 안된다.
(3) 콜로이드 금 제조에 사용되는 증류수는 2중 증류수 또는 3중 증류수 또는 고품질 탈이온수이어야 한다.
(4) 따라서 콜로이드 금 제조를 위한 유리 용기는 절대적으로 깨끗해야 하며, 사용하기 전에 증류수로 절이고 헹구어야 한다. 실리콘화 방법은 클로로포름 용액에 5% 디클로로실란에 몇 분 동안 담가두었다가 증류수로 헹구고 나중에 사용하기 위해 건조시킬 수 있습니다.
(5) 콜로이드 금의 감별 및 보존 : 콜로이드 금을 준비하는 것은 어렵지 않으나 고품질의 콜로이드 금을 만드는 것은 쉽지 않다. 따라서 제조된 콜로이드 금은 매번 시험해야 하며, 주요 검사 지표는 입자 크기, 입자 크기의 균일성, 입자 응집 여부 등이다.
육안 관찰은 가장 기본적이고 가장 간단하고 편리한 확인 방법이지만 어느 정도의 경험이 필요합니다. 좋은 콜로이드 금은 맑고 투명해야 하며, 준비된 금 콜로이드가 혼탁하거나 액체 표면에 떠 있는 물체가 있다면 이번에 준비한 금 콜로이드가 더 많은 응집 입자를 가지고 있음을 나타냅니다. 햇빛 아래에서 콜로이드 금의 색상을 주의 깊게 관찰하고 비교하면 준비된 금 입자의 크기를 대략적으로 추정할 수 있습니다. 물론 분광 광도계를 사용하여 λmax를 스캔하여 금 입자의 입자 크기를 추정할 수도 있습니다. 접합에 의해 제조된 콜로이드 금은 전자현미경으로 가장 잘 관찰되며, 콜로이드 금의 평균 입자 크기를 보다 정확하게 결정할 수 있도록 현미경 사진을 위해 몇 가지 대표적인 것을 선택하였다.
콜로이드 금은 깨끗한 유리 그릇에 오랫동안 보관할 수 있으며 약간의 방부제(예: 0.02% NaN3)를 첨가하면 보존에 도움이 될 수 있습니다. 부적절하게 보관하면 세균이 번식하거나 응집된 입자가 형성될 수 있습니다. 소량의 응집된 입자는 콜로이드 금의 후속 라벨링에 영향을 미치지 않습니다.라벨링 효율을 향상시키기 위해 응집된 입자는 저속 원심 분리로 제거할 수 있습니다.
2. 면역골드의 특성 및 제제
(1) 면역금의 특징
콜로이드 금은 단백질과 같은 다양한 거대분자 물질과 결합될 수 있으며, 면역조직화학적 기술에서는 콜로이드 금과 단백질의 복합체를 통상적으로 금 탐침이라고 부른다. 면역분석에 사용될 때 콜로이드 금은 대부분 면역학적 활성 물질(항원 또는 항체)과 결합되며 이러한 콜로이드 금 접합체는 종종 면역금 복합체 또는 줄여서 면역금이라고 합니다.
콜로이드 금이 단백질에 결합하는 메커니즘은 여전히 매우 명확하며 일반적으로 물리적 흡착으로 여겨집니다. 콜로이드 금 입자는 정전기 유도를 통해 단백질 표면의 양전하에 부착되는 표면 음전하 층을 가지고 있습니다. 따라서 환경 pH 및 이온 강도는 흡착에 영향을 미치는 주요 요인이며 콜로이드 금 입자의 크기, 단백질의 분자량 및 단백질 농도와 같은 기타 요인도 단백질의 흡착에 영향을 미칩니다.
(2) 면역골드의 조제
1. 0.2mol/LK2CO3 또는 0.1mol/LHC1을 사용하여 콜로이드 금 용액의 pH를 선택한 값으로 조정합니다. 원칙적으로 표지할 단백질의 등전점을 선택하거나 약알칼리성일 수 있다. 그러나 일반적으로 최적의 반응 pH는 여러 번의 실험을 통해 결정해야 하는 경우가 많습니다.
콜로이드 금의 pH 값을 조정할 때 콜로이드 금이 pH 측정기의 전극을 차단하고 전극을 콜로이드 금 용액에 직접 삽입할 수 없다는 점에 유의해야 합니다. 콜로이드 금을 폴리에틸렌 글리콜( PEG, 20000) 최종 농도를 0.15로 한 후 콜로이드 금의 pH를 재조정합니다.
2. 콜로이드 금 용액에 1/10 부피의 적절한 농도의 단백질 용액을 첨가하고 실온에서 2-5분 동안 반응시킨다.
염 성분은 단백질에 대한 콜로이드 금의 흡착에 영향을 미쳐 금 콜로이드를 응고시킬 수 있으므로 표지할 단백질 용액에 이온 농도가 높은 경우 표지 전에 탈염을 위해 이온 강도가 낮은 증류수에 투석해야 합니다.
삼. 자유 콜로이드 금을 포화시키기 위해 0.2%의 농도로 PEG 또는 BSA를 추가합니다.
4. 상층액에서 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위한 원심분리기. 원심분리 조건은 콜로이드 금 입자의 입자 크기에 따라 달라지는데, 5nm 금 입자는 40000r/min에서 1시간 동안 원심분리할 수 있고, 8nm 금 입자는 25000r/min에서 45분 동안 원심분리할 수 있으며, 30분 동안 원심분리할 수 있습니다.
5. 상층액을 부드럽게 흡인합니다. PEG 또는 BSA가 포함된 버퍼로 펠릿을 일시 중단하고 원래 부피를 복원한 다음 원심분리합니다. 그래서 2~4번 씻습니다. 결합되지 않은 단백질을 완전히 제거합니다.
6. Immunogold 복합물은 최종적으로 희석제로 준비되고 작업 농도로 저장됩니다. 희석제는 일반적으로 안정제가 첨가된 완충액입니다. 완충 용액은 일반적으로 중성 PBS 또는 Tris 완충액입니다.
