金コロイド、イムノクロマトグラフィーの特性評価と調製
(1) 金コロイドの構造
金ゾルとしても知られるコロイド金は、金塩が元の金に還元された後に形成される金粒子の懸濁液です。 金コロイド粒子は、基本的な金の核（金原子Au）とそれを取り囲む二重イオン層で構成されており、内層のマイナスイオン（AuC12-）は金核の表面に密接に結合しており、外層はイオンのイオン層で構成されています。層 H+ はコロイド溶液中に分散されており、ゾル中にフリーの金コロイドの懸濁状態を維持します。
金コロイド粒子の基本的な金核は理想的な球形核ではなく、より小さな金コロイド粒子は基本的に球形であり、より大きな金コロイド粒子（一般に30nmより大きい）はほとんどが楕円形です。 金コロイドの粒子形態は電子顕微鏡で観察できます。
(2) 金コロイドの特徴
1. コロイドの性質 金コロイド粒子は、その大きさが1～100nmのものが多く、微細な金粒子が液体中に安定かつ均一に単一分散状態で懸濁し、金コロイド溶液を形成します。 したがって、コロイド金はコロイドの多くの特性、特に電解質に対する感受性を備えています。 電解質は金コロイド粒子の周囲の永久水和層を破壊し、それによってコロイドの安定状態を破壊し、分散した単一の金粒子が凝集して大きな粒子になり、液体から沈殿する可能性があります。 タンパク質などの特定の高分子物質は、金コロイドを保護し、その安定性を高めることができます。
2. 演色性 小さな粒子のコロイドは赤色ですが、サイズの異なるコロイドの色には一定の違いがあります。 最小の金コロイド（2～5nm）はオレンジがかった黄色、中程度の大きさの金コロイド（10～20nm）はワインレッド、より大きな金コロイド（30～80nm）は紫がかった赤色です。 この特徴により、金コロイドの色を肉眼で観察することで、金粒子の大きさをおおよそ推定することができます。
3. 光吸収性の金コロイドは可視光領域に単一の光吸収ピークを持ち、その光吸収ピークの波長（λmax）は510～550nmの範囲にあり、金コロイド粒子の大きさによって異なります。 -粒子の金コロイドは長波長に偏っており、逆も同様で、小粒子の金コロイドのλmaxは短波長になる傾向があり、表19-1に一部の金コロイドのλmaxを示します。
(3) 金コロイドの調製
1. 調製方法 金コロイドの調製には、主に還元法が採用されます。 クロラウリン酸 (HauC14) が主な還元物質で、一般的に使用される還元剤はクエン酸ナトリウム、タンニン酸、アスコルビン酸、白リン、水素化ホウ素ナトリウムなどです。 還元剤の種類や還元の強さに応じて、0.8nmから150nmまでの金コロイドを調製できます。 最も一般的に使用される調製方法はクエン酸還元法です。 具体的な操作方法は以下の通りです。
(1) まずHauC14を0.01%水溶液に調製し、100ml取り、加熱して沸騰させます。
(2) 撹拌しながら、1%クエン酸三ナトリウム(Na3C6H5O7・2H2O)水溶液を適量正確に加えます。
(3) そのまま15分間加熱沸騰させます。 このとき、淡黄色の塩化金酸水溶液は、クエン酸ナトリウムを添加するとすぐに灰色に変化し、その後黒色に変化し、その後徐々に赤色に変化することが観察できる。 プロセス全体には約 2 ～ 3 分かかります。
(4) 室温まで冷却後、蒸留水で元の体積に戻します。
この方法により、粒径16～147nmの金コロイドが得られます。 金粒子のサイズは、調製中に添加されるクエン酸三ナトリウムの量によって異なります。 表19-1に粒径の異なる4種類の金コロイドを調製する場合のクエン酸三ナトリウムの添加量を示します。
2. 予防
(1) クロラウリン酸は潮解しやすいので、湿気の少ない光の当たらない場所に保管してください。
(2) 塩化金酸は金属腐食性が高いため、塩化金酸水溶液を調製する際には金属製のヘラを使用して塩化金酸を秤量しないでください。
(3) 金コロイドの調製に使用する蒸留水は、2 回蒸留水または 3 回蒸留水、または高品質の脱イオン水である必要があります。
(4) したがって、金コロイドを調製するためのガラス容器は完全に清潔でなければならず、使用前に酸洗いし、蒸留水ですすいでください。 シリコン処理する方法では、5% ジクロロシランのクロロホルム溶液に数分間浸し、蒸留水ですすぎ、後で使用するために乾燥させます。
（５）金コロイドの識別と保存：金コロイドを調製することは難しくないが、高品質の金コロイドを作ることは容易ではない。 そのため、毎回調製した金コロイドを検査する必要があり、主な検査項目としては、粒子径、粒子径の均一性、凝集粒子の有無などが挙げられます。
目視観察は最も基本的であり、最も簡単で便利な検証方法ですが、ある程度の経験が必要です。 良い金コロイドは無色透明であることが望ましいですが、調製した金コロイドが濁っていたり、液面に浮遊物があったりする場合は、今回調製した金コロイドは粒子の凝集が多いことを意味します。 金コロイドの色を太陽光の下で注意深く観察・比較することで、作製した金粒子の大きさをおおよそ推定することができます。 もちろん、分光光度計を使用して λmax をスキャンして金粒子の粒子サイズを推定することもできます。 接合部で作製された金コロイドは電子顕微鏡で観察するのが最もよく、代表的なものをいくつか選んで顕微鏡写真撮影することで、金コロイドの平均粒径をより正確に求めることができます。
金コロイドは清潔なガラス器具に入れて長期間保存でき、少量の防腐剤 (0.02% NaN3 など) を添加すると保存に役立ちます。 不適切に保管すると、細菌の増殖や凝集粒子の形成が発生する可能性があります。 少量の凝集粒子は、その後の金コロイドの標識に影響を与えませんが、標識効率を向上させるために、低速遠心分離によって凝集粒子を除去することができます。
2. イムノゴールドの特徴と調製
(1) イムノゴールドの特徴
金コロイドはタンパク質などのさまざまな高分子物質と結合させることができ、免疫組織化学的手法では金コロイドとタンパク質の複合体を慣例的に金プローブと呼んでいます。 イムノアッセイで使用される場合、金コロイドは免疫学的に活性な物質 (抗原または抗体) と結合することが多く、そのような金コロイド結合体はしばしば免疫金複合体、または略して免疫金と呼ばれます。
金コロイドがタンパク質に結合するメカニズムはまだ非常に明らかであり、一般的には物理吸着であると考えられています。 金コロイド粒子には表面負電荷の層があり、静電誘導によってタンパク質表面の正電荷に結合します。 したがって、環境の pH とイオン強度が吸着に影響を与える主な要因であり、金コロイド粒子のサイズ、タンパク質の分子量、タンパク質濃度などの他の要因もタンパク質の吸着に影響します。
(2) イムノゴールドの調製
1. 0.2mol/LK2CO3 または 0.1mol/LHC1 を使用して、金コロイド溶液の pH を選択した値に調整します。 原理的には、標識されるタンパク質の等電点を選択するか、弱アルカリ性にすることができます。 ただし、通常、最適な反応 pH は複数の実験を通じて決定する必要があることがよくあります。
金コロイドのpH値を調整する場合、金コロイドがpH計の電極を塞いでしまうため、電極を金コロイド溶液に直接挿入することはできませんので、ポリエチレングリコールなどで金コロイドを安定化させたほうが良いです( PEG, 20000) を最終濃度 0.15 に調整した後、金コロイドの pH を再調整します。
2. 金コロイド溶液に適当な濃度のタンパク質溶液を1/10量加え、室温で2～5分間反応させます。
塩成分は、金コロイドのタンパク質への吸着に影響を及ぼし、金コロイドの凝集を引き起こす可能性があるため、標識するタンパク質溶液に高イオン濃度が含まれる場合には、イオン強度の低い蒸留水に透析して塩を除去する必要があります。ラベリング。
3. 遊離金コロイドを飽和させるために、PEG または BSA を 0.2% の濃度で添加します。
4. 遠心分離して上清中の未結合タンパク質を除去します。 遠心分離条件は金コロイド粒子の粒子サイズに応じて異なります：5nmの金粒子は40000r/minで1時間遠心分離でき、8nmの金粒子は25000r/minで45分間遠心分離でき、30分間遠心分離できます。
5. 上清を静かに吸引します。 PEGまたはBSAを含む緩衝液でペレットを懸濁し、元の体積に戻してから遠心分離します。 そのため、2〜4回洗濯してください。 未結合のタンパク質を完全に除去します。
6. 免疫金複合体は最終的に希釈剤を使用して調製され、使用濃度で保存されます。 希釈剤は通常、安定剤が添加された緩衝液です。 緩衝液は通常中性 PBS または Tris 緩衝液です。
