メチル化特異的 PCR: プロセスの問題と制御!

メチル化特異的 PCR: プロセスの問題と制御!

1. 亜硫酸水素ナトリウムの改質過程で考えられる問題点とその対策

DNA を修飾する亜硫酸水素ナトリウムの目的は、DNA 配列内の非メチル化シトシンをウラシルに完全に変換し、メチル化 5-メチルシトシンは変化しないままにすることです。 このプロセスに影響を与える主な要因は、修飾試薬の濃度、反応温度、反応環境の pH 値、および反応時間です。 いずれかのリンクに問題があると、MSP 増幅の失敗につながります。

体験談は以下の通りです。

（１）重亜硫酸ナトリウムの濃度は３．０〜３．９ｍｏｌ／Ｌに制御することが好ましく、そのｐＨ値はＮａＯＨで５．０に正確に調整しなければならない。

(2) 修飾時間は 10 ～ 16 時間以内に制御する必要があります。修飾時間が長すぎると、メチル化シトシンもウラシルに変換され、DNA 鋳型の損傷が悪化します。時間が短すぎると、変更は不完全になります。

（３）反応温度は５０〜５５℃に制御する（家庭用恒温水槽を使用する場合は５３℃に設定することを推奨）。

(4) DNA テンプレートの量は 2 μg 未満に制御する必要があります。

上記の点に従う限り、基本的に、メチル化シトシンは変化せずに、非メチル化シトシンの 99% がウラシルに変換されることが保証されます。 ただし、この修飾過程で鋳型 DNA の約 96% が分解されているため、DNA サンプルが少ない場合（パラフィン包埋組織、血清 DNA など）、適量のサケ精子 DNA またはグリコーゲン（約 1 g）を使用することができます。 DNA の沈殿を促すキャリアとして添加されます (キャリアを添加した後、エッペンドフ チューブを静かに振って、綿状 DNA 濃縮の現象を確認します)。

2. メチル化特異的 PCR で考えられる問題点とその対策

1. プライマー因子分析 MSP プライマー設計の品質は、増幅を成功させるための重要な因子です。

MSP のプライマー設計原理は、通常の PCR プライマーとは異なり、鋳型 DNA を亜硫酸処理した後、メチル化遺伝子プロモーター領域の CpG アイランドの CpG サイトの 5 末端シトシンを修飾することです。は変化しないままですが、非メチル化 CpG アイランドの CpG 部位の 5 末端シトシンはウラシル、つまり C-U に変換されます。 改変前後の配列の違いに応じて、MethPrimerソフトウェアを用いてメチル化プライマーと非メチル化プライマーを設計し、PCR増幅を行った。 ＭＳＰプライマー配列は、プライマーの特異性を確保し、ＤＮＡプロモーターメチル化塩基の検出率を高めるために、少なくとも１つ以上のＣｐＧ部位、好ましくは複数のＣｐＧ部位を含む。 MSP プライマーは、重亜硫酸ナトリウム処理後の DNA 配列に従って設計する必要があり、また一般的な PCR プライマー設計原則と可能な限り一致している必要があります。 MSP の要件によれば、MSP で DNA 配列を増幅する場合、少なくとも 2 対のプライマー、つまりメチル化プライマーと非メチル化プライマーを合成する必要があります。 MSPの非メチル化プライマー配列では、リーディングプライマーにはグアニン塩基が含まれず、リバースプライマーにはシトシン塩基が含まれません。 初めて MSP に関わる人には、文献の入門書を使用するのが最善です。 新しいメチル化腫瘍抑制遺伝子をスクリーニングする目的で、対応する MSP プライマーが文献で見つからない場合は、オンライン MethPrimer ソフトウェアを使用してオンラインでプライマーを設計できます。 ソフトウェアのプロンプトに従って、必要な MSP プライマーが見つかります。 ただし、MSP の難点は、増幅する必要があるのはプロモーターまたは最初のエクソン配列の一部であり、CG 含量が比較的高いため増幅がより困難であるため、プライマー ソフトウェアを使用するのが最善です。 Primer 5.0 などのプライマーは理論的に増幅効率を推測し、増幅効率が 30% 未満になるようにプライマーを最適化し、増幅効率を高め、増幅の難易度を下げ、PCR 収率を向上させます。

試薬の研究開発: タンパク質保護剤

2. MSP の反応系の問題点 MSP の反応系の構成は通常の PCR と同様であり、反応系の最適化も通常の PCR と同様であるが、反応の最適化との最大の違いは通常のPCRの反応系との違いは、DNAの鋳型が異なることです。

修飾されたテンプレートは一本鎖の状態です。抽出後に MSP DNA テンプレートの純度と含有量をテストする必要があります。純度には、A260/A280 が 1.8 ～ 2.0 である必要があります。場合によっては、DNA 処理が不完全な場合があります。 DNA テンプレートが多すぎると MSP 増幅の失敗につながりますが、DNA テンプレートの添加が少なすぎると試薬が無駄になる一方で、ターゲットフラグメントが少なすぎるために MSP 偽陰性が発生します。 Mg" 濃度は通常 2.0 ～ 2.5 mmoL/L で、​​低すぎても高すぎても増幅にはつながりません。さらに、PCR バッファーと Taq 酵素の供給源も非常に重要であり、一般的な PCR バッファーでは結果が不安定になることがよくあります。 , さまざまなソースからの Taq 酵素も結果の再現性に影響します。CG が豊富な複雑な二次構造テンプレートには、Takara Company の GC Buffer を備えた TaKaRa IATAq の使用をお勧めします。MSP による時間とコストの無駄を避けるため、交換が簡単です再最適化。

3. MSP の反応温度 MSP 増幅の結果を分析するには 3 つの状況があります。

(1) 製品の電気泳動が陰性である。

(2) 製品の電気泳動に複数の非特異的なバンド (標的遺伝子のバンドを含む) が存在します。

(3) 製品の電気泳動は陽性（目的遺伝子のバンドのみ）です。 上記の 2 つの場合、反応系やプライマーに問題がなければ、MSP の反応温度を調整することで目的遺伝子のバンドを得ることができます。

方法は次のとおりです。 PCR 反応では、Tm のレベルは CG の含有量と正の相関があります。 メチル化プライマーと非メチル化プライマーの配列の違いにより、増幅中に PCR バイアスが発生する可能性があります。 変性前温度 (通常 >95°C、10 分間) と変性温度 (>95°C、1 分)、およびアニーリング温度をグラジエントの場合は 60°C、タッチダウン PCR の場合は 70°C に上げることをお勧めします。

試薬の研究開発: タンパク質保護剤

つまり、MSP の全プロセスでは、通常の PCR よりも多くの要因が結果に影響を与えるため、実験プロセスの各ステップを注意深く制御する限り、MSP の精度と精度を完全に向上させることができます。

個人的な意見について話します:

（１）重亜硫酸ナトリウムの濃度は、３．０〜３．９ｍｏｌ／Ｌに制御することが好ましい。 (私たちの研究室の亜硫酸塩はこの濃度よりも高いです)。

(2) 修飾時間は 10 ～ 16 時間以内に制御する必要があります。修飾時間が長すぎると、メチル化シトシンもウラシルに変換され、DNA 鋳型の損傷が悪化します。時間が短すぎると、変更は不完全になります。 (これについてはよく理解しています。なぜなら、上記のように、4 時間では修正が完了しない可能性もあるので、それぞれ 6 時間、12 時間、6 時間かけて実行しました。実際、修正時間は適切であることがわかります)が長すぎてテンプレートのダメージが大きくなり、2週間で劣化してしまいました、その時はPがMだったのですが、その後はUのうちPしか出なくなりました。

(3) DNA テンプレートの量は 2 g 未満に制御する必要があります。 （主に身だしなみ用）