Methylation-specific PCR: 프로세스 문제 및 제어!
1. 아황산수소나트륨 개질 과정에서 발생할 수 있는 문제점 및 대책
DNA를 변형하기 위한 아황산수소나트륨의 목적은 메틸화된 5-메틸시토신이 변하지 않고 남아 있는 동안 DNA 서열에서 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 완전히 전환시키는 것입니다. 이 공정에 영향을 미치는 주요 요인은 개질 시약의 농도, 반응 온도, 반응 환경의 pH 값 및 반응 시간입니다. 모든 링크의 문제는 MSP 증폭 실패로 이어집니다.
경험은 다음과 같습니다.
(1) 아황산수소나트륨의 농도는 바람직하게는 3.0-3.9 mol/L로 제어되며 pH 값은 NaOH로 5.0으로 정확하게 조정되어야 합니다.
(2) 변형시간은 10~16시간 이내로 조절하여야 하며, 변형시간이 너무 길면 메틸화된 사이토신도 우라실로 전환되어 DNA 주형의 손상이 가중되고, 시간이 너무 짧으면 수정이 완료되지 않습니다.
(3) 반응 온도는 50-55℃로 제어되어야 한다(가정용 항온 수조를 사용하는 경우 온도를 53℃로 설정하는 것이 좋습니다).
(4) DNA template의 양은 <2 ug으로 조절해야 합니다.
위 사항을 준수하는 한 기본적으로 메틸화되지 않은 시토신의 99%가 우라실로 전환되고 메틸화 시토신은 변하지 않습니다. 그러나 이 변형 과정에서 주형 DNA의 약 96%가 분해되어 DNA 샘플이 작을 때(파라핀 포매 조직, 혈청 DNA 등) 적정량의 연어 정자 DNA 또는 글리코겐(약 1g)을 추출할 수 있습니다. DNA 침전에 도움이 되는 Carrier로 추가되었습니다(Carrier를 추가한 후 Eppendof 튜브를 부드럽게 흔들어 응집 DNA 농축 현상을 확인하십시오).
2. methylation-specific PCR의 문제점과 대책
1. Primer factor 분석 MSP primer 디자인의 품질은 증폭 성공의 핵심 요소입니다.
MSP의 프라이머 디자인은 일반 PCR 프라이머와 다르며, MSP의 프라이머 디자인 원리는 template DNA에 sulfite를 처리한 후 methylated gene promoter region의 CpG island에 있는 CpG site의 5-terminal cytosine이 메틸화되지 않은 CpG 섬에 있는 CpG 부위의 5말단 시토신은 우라실, 즉 C-U로 전환됩니다. 변형 전과 후의 염기서열 차이에 따라 MethPrimer 소프트웨어로 메틸화 프라이머와 비메틸화 프라이머를 설계하고 PCR 증폭을 수행하였다. MSP 프라이머 서열은 적어도 하나 이상의 CpG 부위, 바람직하게는 다중 CpG 부위를 함유하여 프라이머의 특이성을 보장하고 DNA 프로모터 메틸화 염기의 검출률을 증가시킨다. MSP 프라이머는 아황산수소나트륨 처리 후 DNA 서열에 따라 설계되어야 하며 일반적인 PCR 프라이머 설계 원칙과 가능한 한 일치해야 합니다. MSP의 요구 사항에 따르면 MSP로 DNA 서열을 증폭할 때 적어도 두 쌍의 프라이머, 즉 메틸화된 프라이머와 메틸화되지 않은 프라이머가 합성되어야 합니다. MSP의 메틸화되지 않은 프라이머 서열에서 리딩 프라이머는 구아닌 염기를 포함하지 않으며 리버스 프라이머는 시토신 염기를 포함하지 않습니다. MSP에 처음 참여하는 사람들은 문헌 입문서를 사용하는 것이 가장 좋습니다. 새로운 메틸화 종양 억제 유전자를 스크리닝할 목적으로 해당 MSP 프라이머를 문헌에서 찾을 수 없는 경우 온라인 MethPrimer 소프트웨어를 사용하여 온라인으로 프라이머를 설계할 수 있습니다. 소프트웨어 프롬프트에 따라 필요한 MSP 프라이머를 찾을 수 있습니다. 그러나 MSP가 부딪히는 어려움은 증폭해야 할 것이 프로모터 또는 첫 번째 엑손 서열의 일부이고 그 CG 함량이 상대적으로 높아 MSP를 증폭하기가 더 어렵다는 것이므로 프라이머 소프트웨어를 사용하는 것이 가장 좋습니다. Primer 5.0과 같은 증폭 효율을 이론적으로 추측하여 증폭 효율이 30% 미만인 프라이머를 최적화하여 증폭 효율을 높이고 증폭 난이도를 낮추어 PCR 수율을 높입니다.
시약 R&D: 단백질 보호제
2. MSP의 반응계의 문제점 MSP의 반응계 구성은 일반 PCR과 동일하며, 반응계의 최적화는 일반 PCR과 유사하나, 반응의 최적화와 가장 큰 차이점은 시스템과 일반적인 PCR의 반응 시스템은 DNA 템플릿이 다르다는 것입니다.
수정된 주형은 단일가닥 상태임 MSP DNA 주형의 순도 및 함량은 추출 후 시험해야 함 순도는 A260/A280이 1.8~2.0이어야 함 DNA 주형이 너무 많으면 MSP 증폭이 실패하고, DNA 주형을 너무 적게 추가하면 한편으로는 시약이 낭비되고 다른 한편으로는 너무 적은 표적 조각으로 인해 MSP 위음성이 발생합니다. Mg" 농도는 일반적으로 2.0-2.5mmoL/L이며 너무 낮거나 너무 높으면 증폭에 도움이 되지 않습니다. 또한 PCR 버퍼 및 Taq 효소의 소스도 매우 중요하며 일반적인 PCR 버퍼는 종종 불안정한 결과를 초래합니다. , 다른 출처의 Taq 효소도 결과의 재현성에 영향을 미칩니다. CG가 풍부한 복잡한 2차 구조 템플릿에는 Takara Company의 GC Buffer와 함께 TaKaRa IATAq를 사용하는 것이 좋습니다. 교체가 간편하여 MSP로 인한 시간 및 비용 낭비를 방지합니다. 재최적화.
3. MSP의 반응 온도 MSP 증폭 결과를 분석하는 3가지 상황이 있습니다.
(1) 생성물의 전기영동이 음성이다.
(2) 생성물 전기영동에서 다수의 비특이적 밴드(표적 유전자 밴드 포함)가 있다;
(3) 제품의 전기영동은 양성(표적 유전자 밴드만)이다. 처음 두 경우가 발생했을 때 반응계와 프라이머에 문제가 없는 조건에서 MSP의 반응온도를 조절하면 목적하는 유전자 밴드를 얻을 수 있다.
방법은 다음과 같습니다. PCR 반응에서 Tm의 수준은 CG의 함량과 양의 상관 관계가 있습니다. 메틸화된 프라이머와 메틸화되지 않은 프라이머의 서열 차이로 인해 증폭 중에 PCR 편향이 발생할 수 있습니다. 사전 변성 온도(일반적으로 >95°C, 10 비) 및 변성 온도(>95°C, 1분) 및 그래디언트의 경우 어닐링 온도를 60°C, 터치다운 PCR의 경우 70°C로 높이는 것이 좋습니다.
시약 R&D: 단백질 보호제
요컨대, MSP의 전체 과정에는 일반 PCR보다 결과에 영향을 미치는 요인이 더 많으며 실험 과정의 각 단계를 신중하게 제어하는 한 MSP의 정확도와 정밀도를 완전히 향상시킬 수 있습니다.
개인적인 의견에 대해 이야기하기:
(1) 아황산수소나트륨의 농도는 3.0~3.9mol/L로 조절하는 것이 바람직하다. (저희 실험실의 아황산염은 이 농도보다 큽니다).
(2) 변형시간은 10~16시간 이내로 조절하여야 하며, 변형시간이 너무 길면 메틸화된 사이토신도 우라실로 전환되어 DNA 주형의 손상이 가중되고, 시간이 너무 짧으면 수정이 완료되지 않습니다. (저는 위에서 언급한 바와 같이 수정이 4시간 후에도 완료되지 않을 수도 있다는 의심이 들었기 때문에 이에 대해 깊이 이해하고 있습니다. 그래서 각각 6시간, 12시간, 6시간을 수행했습니다. 실제로 수정 시간이 너무 길어서 템플릿 손상이 가중됨 2주만에 저하됨 당시 P는 M이었는데 나중에는 P out of U가 될 수 밖에 없음.
(3) DNA 템플릿의 양은 2g 미만으로 조절해야 합니다. (주로 미용용)
