PCR検査結果に影響を与える要因

PCR検査結果に影響を与える要因

1. プライマー:

プライマーは PCR における特異的反応の鍵であり、PCR 産物の特異性はプライマーと鋳型 DNA 間の相補性の程度に依存します。

プライマーは次の原則に従って設計する必要があります。

1) プライマーの長さ: 15 ～ 30 bp、通常は約 20 bp。

(2) プライマー増幅範囲: 200 ～ 500 bp が適切で、特定の条件下では最大 10 kb の断片を増幅できます。

(3) プライマー塩基：G+C 含有率は 40 ～ 60% とし、G+C が少なすぎると増幅効果が悪く、G+C が多すぎると非特異的なバンドが出現しやすくなります。 ＡＴＧＣは、５つを超えるプリンまたはピリミジンヌクレオチドのクラスターを避けて、ランダムに分布することが好ましい。

(4) プライマー内の二次構造を避け、2 つのプライマー間の相補性、特に 3' 末端の相補性を避けてください。そうしないと、プライマーダイマーが形成され、非特異的な増幅バンドが生成されます。

(5) プライマーの 3' 末端の塩基、特に最後と最後から 2 番目の塩基は、末端塩基の不一致による PCR の失敗を避けるために厳密にペアリングする必要があります。

(6) プライマーには適切な酵素切断部位が存在するか、または付加することができ、増幅される標的配列には酵素分析や分子クローニングに非常に有益な適切な酵素切断部位が存在することが好ましい。

(7) プライマーの特異性: プライマーは、核酸配列データベース内の他の配列と明らかな相同性を持ってはいけません。 プライマー量: 各プライマーの濃度は 0.1 ～ 1 umol または 10 ～ 100 pmol です。必要な結果を得るには、最も低いプライマー量を使用することをお勧めします。プライマー濃度が高いと、ミスマッチや非特異的増幅が発生し、プライマーの量を増やす 二量体を形成する機会。

2. 酵素とその濃度

現在、Taq DNA ポリメラーゼには 2 種類があり、1 つは Thermus aquaticus から精製された天然酵素、もう 1 つは大腸菌によって合成された遺伝子組み換え酵素です。 一般的な PCR 反応を触媒するには約 2.5 U の酵素が必要です (総反応量が 100 μl の場合) 濃度が高すぎると非特異的増幅が発生し、濃度が低すぎると酵素の量が減少します。合成品は減ります。

3. dNTPの品質と濃度

dNTP の品質は濃度と PCR 増幅効率に密接に関係しており、dNTP 粉末は顆粒状であるため、不適切に保管すると揮発して生物活性が失われます。 dNTP 溶液は酸性であるため、使用前に高濃度に調製し、1 M NaOH または 1 M Tris.HCL 緩衝液で pH 7.0 ～ 7.5 に調整し、少量ずつ小分けして 200℃ の冷凍庫に保管してください。 -20℃。 凍結融解を複数回繰り返すと、dNTP が劣化します。 PCR 反応では、dNTP は 50 ～ 200 umol/L である必要があります。特に 4 つの dNTP のいずれかの濃度が他のものと異なる場合（高いまたは高い）、4 つの dNTP の濃度が等しい（等モル調製）必要があることに注意してください。低い）、不一致の原因となります。 濃度が低すぎると、PCR 産物の収量が低下します。 dNTP は Mg2+ と結合して、遊離 Mg2+ の濃度を下げることができます。

4. 鋳型（標的遺伝子）核酸

鋳型核酸の量と精製度は、PCR の成否を左右する重要な要素の 1 つであり、従来の DNA 精製方法では、通常、SDS とプロテイナーゼ K を使用して検体の消化と処理が行われます。 SDS の主な機能は、細胞膜上の脂質とタンパク質を溶解することにより、膜タンパク質を溶解して細胞膜を破壊し、細胞内の核タンパク質を解離することです。SDS はタンパク質に結合して沈殿させることもでき、プロテイナーゼ K は加水分解することもできます。タンパク質、特に DNA に結合したヒストンを消化し、有機溶媒フェノールとクロロホルムで抽出してタンパク質とその他の細胞成分を除去し、核酸をエタノールまたはイソプロパノールで沈殿させます。 抽出された核酸はPCR反応の鋳型として使用できます。 一般的な臨床検査検体の場合、迅速かつ簡単な方法を使用して、細胞を溶解し、病原体を溶解し、染色体タンパク質を消化して除去して標的遺伝子を遊離し、それらを PCR 増幅に直接使用できます。 RNA テンプレートの抽出では、一般に、RNase による RNA の分解を防ぐために、イソチオシアン酸グアニジンまたはプロテイナーゼ K 法が使用されます。

5. Mg2+濃度

Mg2+ は PCR 増幅の特異性と収量に大きな影響を及ぼしますが、一般的な PCR 反応では、各種 dNTP の濃度が 200 umol/L の場合、適切な Mg2+ 濃度は 1.5 ～ 2.0 mmol/L となります。 Mg2+濃度が高すぎると反応の特異性が低下して非特異的増幅が起こり、濃度が低すぎるとTaq DNAポリメラーゼの活性が低下して反応生成物が減少します。 。

6. 温度と時間の設定

  PCR の 3 ステップの原理に基づいて、変性-アニーリング-伸長の 3 つの温度ポイントが設定されます。 標準反応では、二本鎖DNAを90～95℃で変性させた後、40～60℃に急冷し、プライマーが標的配列にアニールして結合し、その後、70 ～ 75℃まで急速に加熱し、ポリメラーゼの作用により、プライマー鎖が鋳型に沿って伸長します。 より短い標的遺伝子（長さが100～300 bpの場合）の場合は、変性温度に加えて、アニーリング温度と伸長温度を1つに組み合わせた2温度点法が使用できます。一般的には94℃が使用されます。変性には約 65℃、アニーリングと伸長には約 65℃ (この温度 Taq DNase は依然として高い触媒活性を持っています)。

1) 変性温度と時間: 変性温度が低いことと融解が不完全であることが PCR 失敗の主な原因です。 通常、鋳型DNAを変性するには93℃～94℃、1分間で十分ですが、93℃未満の場合は時間を延長する必要がありますが、高温環境下では温度が高すぎないように注意してください。酵素の活性に影響を及ぼします。 このステップで標的遺伝子テンプレートまたは PCR 産物を完全に変性できない場合、PCR の失敗につながります。

(2) アニーリング (リフォールディング) 温度と時間: アニーリング温度は PCR の特異性に影響を与える重要な要素です。 変性後、温度を 40°C ～ 60°C まで急速に冷却し、プライマーとテンプレートを結合させます。 テンプレート DNA はプライマーよりもはるかに複雑であるため、プライマーとテンプレート間の衝突結合の可能性は、テンプレートの相補鎖間の衝突結合の可能性よりもはるかに高くなります。 アニーリングの温度と時間は、プライマーの長さ、その塩基組成とその濃度、ターゲット塩基配列の長さに依存します。 ヌクレオチド数が 20 で、G+C 含量が約 50% のプライマーの場合、最適なアニーリング温度を選択するための理想的な開始点は 55℃ です。 プライマーのアニーリング温度は、次の式によって適切な温度を選択するのに役立ちます。

Tm値（融解温度）＝4（G＋C）＋2（A＋T）

リフォールディング温度＝Tm値－（5～10℃）

Tm 値の許容範囲内で、より高いアニーリング温度を選択すると、プライマーとテンプレート間の非特異的結合が大幅に減少し、PCR 反応の特異性が向上します。 アニーリング時間は通常 30 ～ 60 秒で、プライマーとテンプレートが完全に結合するには十分な時間です。

(3) 伸長温度と時間：Taq DNA ポリメラーゼの生物活性：

70~80℃ 150ヌクレオチド/S/酵素分子

70℃ 60ヌクレオチド/S/酵素分子

55℃ 24ヌクレオチド/S/酵素分子

90℃を超えるとDNA合成が進みにくくなります。

PCR反応の伸長温度は通常70～75℃の間で選択され、一般的には72℃が使用されますが、伸長温度が高すぎるとプライマーと鋳型の組み合わせがうまくいきません。 PCR伸長反応時間は増幅する断片の長さに応じて決定できますが、通常1Kb以内のDNA断片の場合、伸長時間は1分程度で十分です。 3 ～ 4 kb の標的配列の増幅には 3 ～ 4 分かかりますが、10 kb の標的配列の増幅には 15 分かかります。 過度に長い伸長は、非特異的な増幅バンドの出現につながります。 低濃度のテンプレートを増幅する場合、伸長時間はわずかに長くなります。

7. サイクル数

サイクル数によって PCR 増幅の程度が決まります。 PCR サイクル数は主にテンプレート DNA の濃度に依存します。 一般的にサイクル数は30～40回の間で選ばれ、サイクル数が多くなるほど非特異的生成物の量が多くなります。

8. PCR の特異性に影響を与える要因

上記の内容を通じて、PCR の特異性に影響を与える可能性のある要因が数多くあることがわかります。参考のためにここに要約します。

(1) アニーリングステップのストリンジェンシー: アニーリング温度を上げると、ミスマッチのハイブリダイゼーションが減少し、特異性が向上します。

（２）アニーリング時間および伸長時間を短縮することにより、誤開始および誤伸長を減らすことができる。

(3) プライマー二量体は最も一般的な副産物であり、プライマーと酵素の濃度を下げると誤ったプライミング、特にプライマー二量体化も減らすことができます。

(4) MgCl2 の濃度を変更すると特異性が向上する可能性があり、これは反応のストリンジェンシーまたは taq 酵素に直接的な影響を与える可能性があります。

一般に、PCR 産物は電気泳動で 48 時間以内に検出されるべきであると考えられており、一部の PCR 産物は同日の電気泳動で最もよく検出されますが、48 時間後にはバンド パターンが不規則に表示されたり、消えてしまうことさえあります。